检测水中灭菌生物指示物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的具体方法

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根据商务部重要生产资料市场监测系统监测数据显示，

2021年10月11日-2021年10月17日,我市重要生产资料市场价格具体情况如下：

一、钢材批发均价小幅回落

本周我市钢材批发均价为

6055元/吨,环比回落3.5%，其中，棒线材批发价格6055元/吨，环比回落3.5%：高速线材Φ6.5mmHPB300价格6210元/吨，环比回落3.7%；螺纹钢Φ16-25mmHRB400价格5900元/吨，环比回落3.3%。本周钢材批发均价小幅回落，预计后期钢材批发价格会在合理范围内小幅波动。

二、成品油批发均价略有上涨

本周我市成品油批发均价略有上涨。其中，

92﹟汽油批发均价9361.5元/吨、95﹟汽油批发均价9848元/吨、0#柴油批发均价7747.5元/吨, 环比分别上涨2.5%、2%、2.2%。预计后期我市成品油批发价格不会有太大的波动。

玉林市商务局

2021年10月19日

在一些微生物实验室或者需要无菌操作的场所，想了解灭菌的具体效果就需要生物指示物的帮助。通常灭菌指的是用物理或化学的方式将目标微生物全部杀灭，使之达到无菌保障水平，一般最常用的有化学试剂、射线、湿热、干热以及过滤等除菌手段。针对不同的微生物采用的方法也不一样。而想要验证这些方法的效果，就需要一些具有灭菌耐受力的活微生物作为指示物来进行判断。

今天我们要讲的枯草芽孢杆菌黑色变种主要用于各类医疗机构及制药工业领域的消毒效果验证中，其原理是经过灭菌处置后含有枯草芽孢杆菌黑色变种的水样在通过孔径为0.45um的滤膜后，细菌和芽孢被截留在滤膜上，然后将滤膜置于酪氨酸琼脂培养基上，36℃±1℃培养72h-96h，枯草芽孢杆菌黑色变种产生的酪氨酸酶可分解并利用酪氨酸形成黑色素，产生黑色的特征菌落。对特征菌落进行染色镜检后通过生化试验做进一步鉴定，能利用甘油和甘露糖，可还原硝酸盐和水解淀粉，不能利用苦杏仁苷和甘露醇，并确认为革兰氏阳性芽孢杆菌的特征菌落为枯草芽孢杆菌黑色变种，鉴定结果为阳性。

检测所用试剂>

1.酪氨酸琼脂培养基。

2.营养琼脂培养基。

3.淀粉培养基和碘液。

4.硝酸盐还原培养基和相关试剂。

5.甘油复红肉汤培养基。

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6.甘露糖生化培养基。

7.甘露醇生化培养基。

8.苦杏仁苷生化培养基。

9.革兰氏染色液。

10.芽孢染色液。

11.阴性对照菌：如地衣芽孢杆菌。

12.阳性对照菌：枯草芽孢杆菌黑色变种。

13.枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬液

按照《消毒技术规范》的规定制备，也可购买浓度范围在106CFU/ml-109CFU/ml之间的市售枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬液。

评价使用其它灭菌设备的灭菌效果时，灭菌前取适量枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬液加入灭菌设备，使水样中枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢终浓度达到5×104CFU/ml-5×105CFU/ml。灭菌处置完毕后，从灭菌设备中采集水样，进行灭菌生物指示物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的检测。采样量一般为样品瓶容量的80%左右，不得用样品洗涤样品瓶。样品采集完毕后，迅速用无菌包装纸包扎样品瓶。

样品采集后宜在2h内检测，否则应在10℃以下冷藏保存运输，但不得超过6h。实验室接收样品后，不能立即开展检测的，样品应在4℃以下冷藏保存，并在2h内检测。

水样过滤>

用无菌镊子以无菌操作夹取无菌滤膜贴放在已灭菌的过滤装置上，固定好过滤装置。将样品充分混匀后取100 ml 抽滤，以无菌水冲洗滤器内壁2-3 次。样品过滤完成后，再抽气约5s，关上开关。过滤前按照无菌操作要求调节样品的pH值至7.0-8.0。

培养流程>

用灭菌镊子夹取滤膜移放在酪氨酸琼脂培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后用石蜡质封口膜封好培养皿，倒置培养皿，放入恒温培养箱内，36℃±1℃培养72h-96h。

培养96h后，如培养基上未有菌落生长，则试验终止；如培养基上有菌落生长，则挑取黑色的特征菌落于营养琼脂培养基上，36℃±1℃培养24h，待鉴定。同时将已挑菌落的酪氨酸琼脂培养基培养皿储存于2℃-5℃，以备必要时复查。

染色镜检>

挑取黑色或可疑菌落，分别使用革兰氏染色液和芽孢染色液染色，枯草芽孢杆菌黑色变种革兰氏染色镜检以及芽孢染色镜检可以参考相关镜检图，枯草芽孢杆菌黑色变种为革兰氏阳性菌，营养细胞呈杆状，单个或呈短链状排列。

生化实验>

挑取黑色或可疑菌落，分别接种到淀粉培养基、硝酸盐还原培养基、甘油复红肉汤培养基、甘露糖生化培养基、甘露醇生化培养基和苦杏仁苷生化培养基上。

空白对照实验>

用无菌水按照过滤和培养步骤进行操作；培养96h后平板培养基上应无菌落生长，否则，该次样品鉴定结果无效，应查明原因后重新采样和检测。

阴性及阳性对照>

将阴性对照菌和阳性对照菌制成浓度为40CFU/L-600CFU/L的菌悬液，分别按照过滤、培养、实验的步骤操作。阴性、阳性对照菌呈现的生化反应结果应与参照表所列结果一致，否则该次水样鉴定结果无效，此时查明原因后重新采样和检测。

结果判断>

100ml水样中检出枯草芽孢杆菌黑色变种，即可断定灭菌不合格；而如果在100mL水样中未检出枯草芽孢杆菌黑色变种，可评价为灭菌合格。

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